Заведующий лабораторией:д. б. н., профессор Розенфельд Марк Александрович
Телефон отдела:—
Почта:—
Комната:—
Одним из научных направлений лаборатории термодинамики биосистем является исследование структуры и функции белков в растворе и влияние на них свободнорадикального окисления. Одним из таких белков является фибриноген, основной функцией которого является поддержание гемостаза за счет образования фибриновых сгустков при действии тромбина на фибриноген и последующего ковалентного сшивания фибрина фибринстабилизирующим фактором (FXIIIa). Фибриноген, являясь представителем широкого класса моносубъединичных белков, уникален в своей структурной архитектуре. К тому же он – наиболее легко окисляемый белок, что оказывает влияние на структуру и свойства фибринового геля. Все это предопределяет огромный интерес исследователей к проблеме свободнорадикального окисления фибриногена как кардиоваскулярного фактора риска.
За последние в лаборатории изучены механизмы нарушения как молекулярной структуры, так и пространственной организации фибриногена, обработанного озоном. ИК-анализ показал, что озон-индуцированное окисление белка приводит к росту содержания гидроксильных, карбонильных и карбоксильных групп. Аналогичный анализ D и Е фрагментов фибриногена, выделенных из окисленного белка, также выявил трансформацию отдельных важных функциональных групп. В частности, наблюдалось значительное распад N-H-групп внутри пептидного остова, а также снижение содержания C-H-групп, принадлежащих либо ароматическим фрагментам, либо группам CH2 и CH3 алифатической цепи. Проведенные модельные эксперименты с использованием селективных ловушек гидроксильных радикалов, впервые показали, что распад алифатических звеньев может быть вызван только действием гидроксильных радикалов, которые образуются в водном растворе из озона. В целом, данные ИК-спектроскопии позволили установить, что фрагменты D, являющиеся гомологами периферических областей фибриногена, заметно более чувствительны к окислению, чем фрагменты E, сходные по структуре с центральной областью фибриногена.
Интересные новые данные по спонтанной самосборке молекул фибриногена были получены с использованием методов упругого и динамического рассеяния света (2014-2016 г.г.). В присутствии FXIIIa молекулы как неокисленного, так и окисленного фибриногена связываются друг с другом «конец к концу», образуя гибкоцепные ковалентно-сшитые гомополимеры фибриногена. Оказалось, что γ- и α-полипептидные цепи окисленного фибриногена участвуют в ферментативном перекрестном сшивании в большей степени, чем цепи незатронутого индуцированном окислением фибриногена. Более активный FXIIIa-опосредованный процесс сборки сшитых фибриновых протофибрилл и волокон, построенных из молекул окисленного мономерного фибрина, обусловлен усилением так называемых D:D взаимодействий между соседними D областями контактирующих молекул. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что усиление продольных D:D-взаимодействий становится более важным в сборке растворимых протофибрилл в тех случаях, когда структура основных сайтов, ответственных за образование протофибрилл, повреждена их окислением. Экспериментальные данные по окислению фибриногена, полученные в настоящем исследовании, в сочетании с нашими более ранними результатами, позволили предположить, что пространственная структура фибриногена может быть эволюционно адаптирована к действию активных форм кислорода.
Этот принципиально важный вывод нашел подтверждение при исследовании окислительной модификации фибриногена методом масс-спектрометрии высокого разрешения. Было обнаружено, что множество аминокислотных остатков, принадлежащих всем трем полипептидным цепям и основным структурным областям белка вовлекается в окислительную модификацию, при этом αC-коннектор представлял собой самую уязвимую мишень для АФК по сравнению с другими структурными частями, в то время как центральная E область оказалась наиболее защищенной от токсического действия окислителей. Впервые было установлено, что многочисленные «жизненно важные» в функциональном отношении аминокислотные остатки, ответственные за превращение фибриногена в фибрин, остаются незатронутыми при окислении фибриногена. Полученные данные, демонстрировали поразительный факт – ни один из идентифицированных остатков, которые входят в состав главных центров самосборки фибрина, а также остатки, ответственные за связывание тромбина с областью Е фибриногена, не подвергались никаким химическим изменениям при окислении. Таким образом, данные по окислению фибриногена, полученные в настоящем исследовании, позволяют предположить, что некоторые структурные части фибриногена, в частности, αC-домены и некоторые легко окисляемые аминокислотные остатки метионинов могут быть наделены антиоксидантными свойствами, а сама молекула в целом может рассматриваться как высоко организованная структура, сохраняющую способность к функционированию даже в условиях сильного окислительного стресса.
Хотелось бы кратко остановиться еще на одной нашей важной работе, связанной с образованием фибрина. В течение достаточно долгого времени существовали взаимоисключающие друг друга точки зрения, касающаяся геометрии изопептидных γ-γ-связей, образующихся между γ-полипептидными цепями соседних мономерных молекул фибрина. Пространственное расположение этих связей имеет принципиальное значение для понимания реологических свойств ковалентно-сшитого фибрина. Одна группа ученых считала, что γ-γ-связи ориентированы продольно, т.е. образуются между γ-цепями контактирующих молекул, принадлежащих одной и той же одноцепочечной нити двуцепочечной профибриллы, в то время как другая группа исследователей пыталась доказать, что γ-γ-связи ориентированы поперек направления протофибриллы, т.е. γ-γ-связи обусловлены сшиванием молекул, принадлежащих разным нитям протофибриллы. Несмотря на использование различных методологических подходов полученным результатам недоставало решающих аргументов в пользу той или другой точки зрения. Для определения ориентации этих связей мы применили принципиально новый подход, основанный на самосборке растворимых сшитых протофибрилл фибрина, происходящей в растворе мочевины умеренных концентраций с последующей диссоциацией протофибрилл в условиях повышения концентрации мочевины. Результаты упругого и динамического рассеяния света в сочетании с аналитическим ультрацентрифугированием однозначно свидетельствовали о том, что протофибриллы проявляли способность диссоциировать при увеличении концентрации мочевины с образованием одноцепочечных структур. Этот эффект неопровержимо доказал продольную ориентацию γ-γ-связей.
Другим белком, интенсивно изучаемым в нашей лаборатории, является плазменный фибринстабилизирующий фактор (pFXIII). Фибринстабилизирующий фактор плазмы представляет собой гетеротетрамерный профермент, состоящий из двух каталитических субъединиц A (FXIII-A2) и двух регуляторных субъединиц B (FXIII-B2). Основной функцией белка, как указывалось ранее, является образование поперечных связей между полипептидными цепями фибринового сгустка. Превращение pFXIII в ферментативную форму FXIII-A2* - многоступенчатый процесс. Как и многие другие белки плазмы крови, pFXIII является мишенью, чувствительной к окислителям. Наш коллектив оказался первым и пока единственным, который начал планомерные исследования влияния индуцированного окисления на структуру и механизм функционирования этого важного белка. Было обнаружено, что вызванное озоном окисление pFXIII влияет на ферментативную активность FXIIIa, которая в значительной степени зависит от стадии превращения профермента в фермент, на котором проводилось окисление. Результаты ИК- и комбинационной спектроскопии обнаружили химические превращения циклических, NH, SH и S-S групп. Используя метод динамического светорассеяния удалось показать, что трехмерная структура pFXIII становится разрыхленной благодаря окислительной модификации. Данные ЭПР-спектроскопии также выявили конформационные изменения фибринстабилизирующего фактора при окислении. Важно отметить, что превращение pFXIII в фермент повышало уязвимость белка к окислению. Впервые с помощью масс-спектрометрии был идентифицирован набор сайтов окисления в FXIII-A2 при озон-индуцированном окислении pFXIII на разных стадиях его активации, и была изучена степень, а также химическая природа этих модификаций. Было показано, что совокупность аминокислотных остатков, подверженных окислительной атаке, и степень их окисления в каталитической субъединице FXIII-A2 не активированного профермента pFXIII, профермента, активированного Ca2+, и полностью активированного pFXIII, обработанного тромбином и Ca2+, значительно различаются. Полученные данные позволяют постулировать, что в процессе превращения профермента в FXIII-A2* новые ранее неэкспонированные аминокислотные остатки становятся доступными для окислителя, в то время как некоторые из первоначально экспонированных на поверхности остатков скрыты внутри белковой глобулы. Тот факт, что pFXIII, обработанный Са2+, был более уязвим к окислению относительно нативного аналога, может указывать на антиоксидантную роль субъединиц FXIII-В. Антиоксидантная функция субъединицы B может объяснить, тот факт, что сама по себе субъединица A, т.е. лишенная экранирующих ее FXIII-В, нестабильна в плазме.
В лаборатории наряду с фибриногеном и фибринстабилизирующим фактором были проведены исследования по окислительной модификации ряда других белков (альбумин, плазминоген и др.), результаты которых в совокупности с имеющимися данными в литературе впервые позволили сформулировать представление об антиоксидантной структурной эволюции белков. Некоторые из структурных участков в белках (различные субдомены, домены, области и полипептидные цепи), главным образом, способны служить как ловушки для АФК, защищая тем самым от токсического действия окислителей функционально важные аминокислотные остатки, локализованные в других белковых структурах.
Другим направлением работ является исследование в области структурной и функциональной модификации белков крови на поверхности нано-, микро- и макрообъектов, а также работы по созданию функциональных систем на основе магнитных наночастиц, включающих макромолекулы белков, для задач биологии и медицины. Сотрудниками лаборатории разработан не имеющий аналогов в России и за рубежом способ свободнорадикального сшивания макромолекул белков на поверхностях частиц, содержащих ионы металлов переменной валентности (патент РФ № 2484178 10.06.2013, приоритет от 08.09.2011). Продемонстрированы возможности способа при получении устойчивых монослойных белковых покрытий, включающих белки различного функционального назначения – сывороточный альбумин, ферменты, антитела; доказано сохранение функциональных свойств белков в составе многокомпонентных покрытий, которые могут найти использование для решения широкого спектра социально значимых задач биологии и медицины. На модели крыс изучается специфическая активность и возможности контрастирования опухоли синтезированными в лаборатории и модифицированными магнитными наночастицами. В 2012 году научный сотрудник А.В. Бычкова защитила диссертацию на соискание степени кандидата химических наук «Создание устойчивых макромолкулярных покрытий на магнитных наночастицазх для применения в биологии и медицине».
С 2016 года в лаборатории проводятся перспективные исследования в области гибридных белок-содержащих систем на основе магнитных наночастиц с широким диапазоном функциональных возможностей для таргетной тераностики опухолевых заболеваний (совмещения векторной и стимул-чувствительной доставки лекарственных препаратов к клеткам-мишеням, локализации систем в опухоли за счет магнитного поля, проведения магнитно-резонансных исследований, гипертермии, а также запуска процессов ферроптоза – гибели опухолевых клеток). Ожидается, что полученные результаты будут способствовать углублению имеющихся фундаментальный и прикладных представлений о причинах и протекании химических и конформационных превращений молекул белков на поверхности магнитных наночастиц при введении наночастиц, обладающих пероксидазной активностью, в биологические жидкости и превращений молекул белков в составе белок-содержащих покрытий на поверхности таких наночастиц, предопределяющих поведение наносистем в биологических тканях и жидкостях и особенности биораспределение наносистем в организме.
В задачи лаборатории входит также адаптация современных приборных физико-химических методов анализа к системам с неоднородной структурой, содержащим частицы различных размеров и состава, вовлекающимся во взаимодействия с биологическими молекулами или с другими частицами в различных средах. Исследование этих взаимодействий важно при создании искусственных функциональных систем и при прогнозировании их поведения в биологических жидкостях. Изучается влияние различных факторов на адсорбцию на поверхности частиц белков индивидуально и в составе композиций; проводится термодинамическое описание взаимодействия белков с поверхностью наночастиц в жидких дисперсионных средах; разрабатываются подходы к оценке устойчивости белковых покрытий в биологических жидкостях на основе конкурентных адсорбционных процессов. Исследования выполняются биохимическими и физико-химическими методами, в том числе, методами дифференциальной сканирующей калориметрии, изотермической титрационной калориметрии, динамического светорассеяния, спектрофотометрии УФ/видимой области, методами магнитного резонанса и масс-спектрометрии. Результаты по вытеснению фибриногеном и иммуноглобулином G сывороточного альбумина с поверхности наночастиц получены с применением перечисленных методов впервые.
В последнее время в лаборатории ведутся исследования биосистем с помощью нового метода оптической ловушки (лазерного пинцета). Были выполнены прямые количественные исследования сил связывания липополисахаридов наружной мембраны патогенных бактерий с живыми макрофагами. Изучение молекулярно-силовой картины адгезии бактериальной мембраны к иммунокомпетентным клеткам организма фундаментально является значимым для выяснения биофизических механизмов инфицирования организма. Оно важно также для разработки принципиально новых подходов в борьбе с инфекционными заболеваниями. Одним из таких подходов является антиадгезивная терапия, основанная на подавлении первоначальной адгезии патогенных бактерий вместо попыток их уничтожения на постадгезионной стадии. Для исследований были выбраны липополисахариды двух наиболее опасных патогенов из рода Yersinia – возбудителей псевдотубекулёза и чумы.
Ведущим научным сотрудником лаборатории В.Л. Кононенко выполнены исследования на экспериментальной модели «функционализированная липополисахаридами микросфера в лазерном пинцете – макрофаг» методом оптического пинцета и специально разработанной методики регистрации сил взаимодействия этих объектов в диапазоне от единиц до десятков пиконьютонов. В процессе разработки методики был обнаружен, исследован и теоретически описан новый оптико-физический эффект - эффект «тени» объекта в методе оптического пинцета. Эффект принципиально значим для корректного использования этого метода в экспериментах с любыми объектами клеточных размеров. В результате исследований были впервые зарегистрированы спектры сил адгезии липополисахаридов бактериальной стенки патогенных бактерий Yersinia к мембране иммунной клетки – макрофага линии J774. На этой экспериментальной основе был сформулирован общий механизм формирования таких адгезионных спектров, предполагающий неспецифическое связывание О-антигена липополисахарида с поверхностью макрофага и рецепторное связывание с этой поверхностью области кора липополисахарида.
Сотрудники лаборатории термодинамики биосистем в 2013-2019гг публикуют свои научные статьи в таких высокорейтинговых журналах с высоким импакт-фактором, как Bioch. Bioph. Acta., Free Radic. Res., Free Radic. Biol. Med.; выступают с устными и стендовыми докладами на престижных международных конференциях и симпозиумах в России и за рубежом, участвуют в организации и проведении Дней открытых дверей Института для привлечения студентов и дипломников различных ВУЗов Москвы, проводят для них ознакомительные семинары по тематикам исследований лаборатории.
Молодые сотрудники лаборатории ежегодно становятся лауреатами конкурса научных работ им. Елены Борисовны Бурлаковой. Так, работа н.с., к.х.н. А.В. Бычковой «Окислительные модификации фибриногена и их функциональные последствия заняла почетное третье место в конкурсе 2017 года, работа аспирантки А.Д. Васильевой «Структурная антиоксидантная адаптация белков (на примере фибриногена и плазменного фибринстабилизирующего фактора)» - почетное третье место в конкурсе 2018 года, а работа аспирантки Л.В. Юриной «Озон-индуцированное повреждение молекулы фибриногена: идентификация участков окисления методом масс-спектрометрии высокого разрешения» - почетное третье место в конкурсе 2019 года. Аспирантка А.Д. Васильева также стала победителем конкурса 2018-2020 года на получение стипендии Президента Российской Федерации студентам и аспирантам, осваивающим образовательные программы высшего образования в организациях, находящихся в ведении Министерства науки и высшего образования РФ. Грант Президента Российской Федерации на 2019-2020 годы для молодых российских ученых – кандидатов наук и докторов наук на финансирование фундаментальных и прикладных исследований получила с.н.с., к.х.н. А.В. Бычкова за работу «Исследование пероксидазной активности гибридных белок-содержащих систем на основе магнитных наночастиц, поиск новых систем тераностики опухолевых заболеваний».
В заключение хотелось бы сказать, что сформулированные нами научные идеи и самые современные методические подходы, используемые в лаборатории для решения поставленных задач, помогут в ближайшем будущем получить еще ряд очень интересных и плодотворных результатов по основным направлениям исследований.
